當前位置：首頁 > 技術文章 > 免疫印跡技術（Western Blotting）常見問題及解決方案

免疫印跡技術（Western Blotting）常見問題及解決方案

更新時間：2025-10-09 點擊次數：190

免疫印跡實驗（Western Blotting）雖原理明確，但涉及多步驟操作（樣品制備、電泳、轉膜、免疫反應、信號檢測），任何環(huán)節(jié)的參數偏差或試劑問題都可能導致實驗失敗。本文聚焦實驗中最常見的條帶異常、背景干擾、信號缺失、定量不準四大類問題，結合分子生物學機制分析成因，提供可落地的解決方案，并關聯羅氏試劑的技術優(yōu)勢與上海易匯生物的供應服務，幫助科研人員快速排查問題，提升實驗成功率。

一、條帶異常類問題：從 “條帶形態(tài)" 定位實驗漏洞

條帶異常是免疫印跡實驗中最直觀的問題，主要表現為 “無目標條帶、條帶模糊、條帶偏移、多一條 / 少一條帶"，需從 “蛋白質分離 - 結合 - 檢測" 全流程追溯成因。

（一）問題 1：無目標條帶（檢測不到條帶）

可能成因

樣品制備環(huán)節(jié)：蛋白質未提取或降解（未加蛋白酶抑制劑）、樣品上樣量不足（低于檢測下限，如目標蛋白含量＜1 pg）；

電泳環(huán)節(jié)：凝膠濃度不匹配（如檢測 20 kDa 小蛋白用 10% 凝膠，蛋白跑出色譜膠）、電泳時間過長（蛋白遷移至凝膠外）；

轉膜環(huán)節(jié)：轉膜方向反了（蛋白未轉移到膜上，仍留在凝膠中）、轉膜效率低（如 PVDF 膜未用甲醇激活，無法吸附蛋白）；

免疫反應環(huán)節(jié)：一抗與目標蛋白不匹配（如用兔抗小鼠蛋白抗體檢測人源樣本）、一抗?jié)舛冗^低（如 1:10000 稀釋導致結合不足）、抗體失效（反復凍融或過期）；

信號檢測環(huán)節(jié)：ECL 底物過期（發(fā)光效率下降）、成像時間過短（未捕獲到弱信號）。

解決方案

樣品制備排查：

用 BCA 法（如羅氏 BCA Protein Assay Kit）檢測蛋白質濃度，確保上樣量≥20 μg（或目標蛋白含量≥1 pg）；

提取時添加新鮮的蛋白酶抑制劑（如羅氏 Complete™ Protease Inhibitor Cocktail，含 6 種抑制劑，可抑制絲氨酸 / 半胱氨酸蛋白酶等），避免蛋白質降解；

電泳與轉膜驗證：

根據目標蛋白分子量選擇凝膠濃度（參考：10-50 kDa 用 15% 凝膠，50-100 kDa 用 10% 凝膠，100-200 kDa 用 8% 凝膠），電泳后用考馬斯亮藍染色凝膠，確認蛋白已進入凝膠且未跑穿；

轉膜前用甲醇浸泡 PVDF 膜 10 秒（激活羥基），轉膜后用麗春紅 S 染色膜，觀察是否有蛋白質條帶（若有則證明轉膜成功，無則檢查轉膜方向或緩沖液）；

免疫反應優(yōu)化：

核對一抗說明書，確認種屬匹配（如檢測人 EGFR 需用抗人 EGFR 抗體，而非抗小鼠 EGFR），優(yōu)先選擇經過驗證的單克隆抗體（如羅氏 Anti-EGFR Monoclonal Antibody，經 WB 驗證，特異性＞99%）；

調整一抗?jié)舛龋ㄍ扑]起始濃度 1:1000-1:5000），4℃孵育過夜（延長結合時間），洗膜時用 TBST 緩沖液（含 0.1% Tween-20）充分洗滌（3 次 ×15 分鐘），避免未結合抗體殘留；

信號檢測保障：

使用新鮮的 ECL 底物（如羅氏 Lumi-Light™ Plus Substrate，發(fā)光時間長達 8 小時），先進行 5 分鐘預曝光，若信號弱則延長至 10-30 分鐘，或使用高靈敏度成像儀（如羅氏 ChemiDoc™ MP Imaging System，檢測下限達 0.1 pg）。

（二）問題 2：條帶模糊（條帶無清晰邊緣，呈 “拖尾" 或 “彌散狀"）

可能成因

樣品制備：蛋白質未充分變性（如 SDS 上樣緩沖液未加 β- 巰基乙醇，或加熱時間不足）、樣品中含大量雜質（如鹽濃度過高，導致電泳時蛋白遷移不均）；

電泳環(huán)節(jié)：凝膠聚合不均（APS 或 TEMED 添加量不足，導致凝膠孔徑不一致）、電泳緩沖液反復使用（離子濃度下降，導電性減弱）；

轉膜環(huán)節(jié)：轉膜電流過大（膜發(fā)熱導致蛋白擴散）、凝膠與膜之間有氣泡（局部轉膜不，條帶斷裂）。

解決方案

樣品處理優(yōu)化：

確保上樣緩沖液中 β- 巰基乙醇終濃度為 5%，95℃加熱 10 分鐘（而非 5 分鐘），使蛋白質變性（線性化）；

若樣品鹽濃度高（如從高鹽緩沖液中提?。猛肝龃ń亓舴肿恿?3 kDa）透析 24 小時（換液 3 次），或使用脫鹽柱（如羅氏 HiTrap™ Desalting Columns）去除鹽分；

電泳條件控制：

使用新鮮配制的電泳緩沖液（Tris - 甘氨酸 - SDS 緩沖液，pH 8.3），避免反復使用（建議使用次數≤3 次）；

選擇預制膠（如羅氏 ExcelGel™ SDS 預制膠，工廠標準化生產，孔徑均勻性 CV 值＜5%），避免手動制膠導致的聚合不均；

轉膜操作規(guī)范：

采用恒壓轉膜（而非恒流），根據膜面積調整電壓（如 7 cm×8 cm 膜用 25 V 轉膜 30 分鐘），轉膜時在冰浴中進行（避免膜發(fā)熱）；

鋪膜時用玻璃棒輕輕滾動，排除凝膠與膜之間的氣泡（可在膜上滴加少量轉膜緩沖液，幫助氣泡排出）。

（三）問題 3：條帶偏移（目標條帶分子量與預期不符）

可能成因

蛋白質修飾影響：目標蛋白存在翻譯后修飾（如磷酸化、糖基化、泛素化），導致分子量增大（如未磷酸化的 ERK 分子量約 42 kDa，磷酸化后因電荷變化，遷移速度減慢，條帶偏移至 45 kDa 左右）；

電泳參數偏差：凝膠濃度錯誤（如檢測 40 kDa 蛋白用 15% 凝膠，而非 10%，導致蛋白遷移過快，條帶分子量偏?。?、電泳電壓過高（遷移速度加快，條帶位置偏上）；

樣品降解：蛋白質部分降解（如提取后未及時檢測，導致 C 端或 N 端片段斷裂），出現 “小分子量雜帶"，誤判為目標條帶。

解決方案

修飾驗證：

若懷疑磷酸化修飾，可同時檢測磷酸化與非磷酸化形式（如用羅氏 Anti-p-ERK 與 Anti-ERK 抗體，前者條帶偏移，后者為標準分子量）；

若為糖基化修飾，用糖苷酶（如 PNGase F）處理樣品（37℃孵育 1 小時），去除糖鏈后再電泳，觀察條帶是否恢復至預期分子量；

電泳參數校準：

嚴格按照目標蛋白分子量選擇凝膠濃度（參考表 1），并使用蛋白分子量標準品（如羅氏 Precision Plus Protein™ Standards，含 10 種蛋白，分子量 10-250 kDa），每次實驗均上樣標準品，校準條帶位置；

控制電泳電壓（濃縮膠 80 V，分離膠 120 V），避免電壓過高（如 150 V）導致遷移速度異常；

降解防控：

蛋白質提取后立即進行電泳（或 - 80℃分裝保存，避免反復凍融），若需長期保存，添加蛋白酶抑制劑（如羅氏 Complete™ Mini EDTA-free，適合金屬蛋白酶抑制）。

目標蛋白分子量（kDa）	推薦凝膠濃度（%）	電泳時間（分離膠，120 V）
10-50	15	40-50 分鐘
50-100	10	60-70 分鐘
100-200	8	80-90 分鐘

二、背景干擾類問題：從 “信號背景比" 優(yōu)化實驗條件

背景干擾表現為 “膜整體發(fā)光（高背景）、條帶周圍有光暈（局部背景）、出現非特異性雜帶"，核心原因是 “非特異性結合" 或 “試劑污染"，需通過封閉、洗膜、抗體選擇等環(huán)節(jié)優(yōu)化。

（一）問題 1：膜整體發(fā)光（高背景，無法分辨目標條帶）

可能成因

封閉不充分：封閉液選擇錯誤（如檢測磷酸化蛋白用脫脂牛奶，牛奶中內源性磷酸酶與抗體交叉反應）、封閉時間過短（如室溫孵育 30 分鐘，覆蓋非特異性位點）；

抗體非特異性結合：一抗?jié)舛冗^高（如 1:500 稀釋，導致非特異性結合增多）、二抗與膜或封閉液成分交叉反應（如用羊抗兔二抗檢測兔源封閉蛋白）；

試劑污染：ECL 底物污染（如混入雜質，導致非特異性發(fā)光）、膜被熒光物質污染（如戴手套接觸膜，手套上的熒光劑殘留）。

解決方案

封閉條件優(yōu)化：

根據檢測目標選擇封閉液（參考表 2），如檢測磷酸化蛋白或生物素標記抗體，優(yōu)先用 3% BSA（如羅氏 Albumin from Bovine Serum，無內源性磷酸酶與生物素），避免用脫脂牛奶；

延長封閉時間（室溫 2 小時或 4℃過夜），封閉過程中持續(xù)搖床振蕩（50 rpm），確保封閉液均勻覆蓋膜表面；

抗體濃度調整：

降低一抗?jié)舛龋ㄈ鐝?1:500 調整為 1:2000），并進行梯度稀釋實驗（1:1000、1:2000、1:5000），選擇 “條帶清晰且背景低" 的最佳濃度；

選擇交叉反應率低的二抗（如羅氏 HRP-Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG，經親和純化，與小鼠 IgG 交叉反應率＜0.5%），二抗?jié)舛瓤刂圃?1:5000-1:10000；

污染防控：

使用新鮮開封的 ECL 底物，避免反復使用（單次使用后丟棄剩余底物）；

操作時戴無粉手套，避免用手直接接觸膜（可使用鑷子夾取膜邊緣），膜的存放環(huán)境避免熒光燈直射（防止熒光物質激發(fā)）。

檢測目標	推薦封閉液	避免使用的封閉液	原因分析
普通蛋白質（非修飾）	5% 脫脂牛奶	-	成本低，封閉效果好
磷酸化蛋白	3% BSA	脫脂牛奶	牛奶含內源性磷酸酶，干擾信號
生物素標記抗體	3% BSA	脫脂牛奶	牛奶含內源性生物素，交叉反應
低豐度蛋白質	5% 脫脂牛奶 + 0.1% Tween-20	純 BSA	添加 Tween-20 增強封閉效果

（二）問題 2：非特異性雜帶（除目標條帶外，出現額外條帶）

可能成因

抗體特異性差：一抗為多克隆抗體（識別多個表位，與同源蛋白交叉反應）、一抗與樣品中其他蛋白有同源序列（如檢測 EGFR 時，與 ERBB2 蛋白交叉反應）；

蛋白降解或聚合：樣品中目標蛋白部分降解（產生小分子量片段，形成雜帶）、蛋白質聚合（如加熱不充分，形成二聚體 / 三聚體，出現大分子量雜帶）；

轉膜污染：轉膜時凝膠中的蛋白轉移到膜的非預期區(qū)域（如相鄰泳道的蛋白擴散，形成橫向雜帶）。

解決方案

抗體選擇優(yōu)化：

優(yōu)先使用單克隆抗體（如羅氏 Anti-KRAS Monoclonal Antibody，僅識別 KRAS 蛋白的特定表位，交叉反應率＜0.1%），避免使用多克隆抗體；

查閱抗體說明書，確認是否有 WB 驗證數據（如是否標注 “僅在 42 kDa 處出現單一條帶"），選擇經過同行評審的抗體；

樣品處理改進：

提取后立即添加蛋白酶抑制劑（如羅氏 Complete™ Protease Inhibitor Cocktail），并在 - 80℃分裝（避免反復凍融導致降解）；

確保上樣緩沖液中 SDS 濃度為 2%，95℃加熱 10 分鐘，使蛋白質解聚（避免二聚體形成）；

轉膜與電泳控制：

上樣時避免樣品溢出（每個泳道上樣量不超過泳道體積的 80%），電泳時使用新鮮緩沖液，避免蛋白擴散；

轉膜后用麗春紅 S 染色，確認相鄰泳道無蛋白交叉污染，若有則增加泳道間距或降低上樣量。

三、信號與定量類問題：從 “數據可靠性" 提升實驗重復性

信號與定量問題直接影響實驗結論的可靠性，主要表現為 “信號弱、信號不穩(wěn)定、定量結果重復性差"，需從試劑質量、操作標準化、儀器校準等方面解決。

（一）問題 1：信號弱（目標條帶亮度低，難以定量）

可能成因

目標蛋白豐度低：樣品中目標蛋白含量低于檢測下限（如＜0.1 pg）、樣品上樣量不足（如僅上樣 5 μg 蛋白）；

抗體親和力低：一抗與目標蛋白的親和力常數（KD）過大（如＞10?? mol/L，結合能力弱）、二抗偶聯效率低（如酶與抗體的偶聯比例 DOL＜1，信號放大不足）；

檢測系統(tǒng)靈敏度低：ECL 底物發(fā)光效率低（如普通底物，而非增強型）、成像儀檢測限高（如無法捕獲皮克級信號）。

解決方案

樣品富集與上樣優(yōu)化：

若目標蛋白豐度低（如血清中的細胞因子），使用免疫沉淀（IP）富集（如羅氏 Protein G Sepharose™ 4 Fast Flow，特異性結合抗體 - 抗原復合物），富集后再進行 WB 實驗；

增加上樣量（如從 10 μg 增至 30 μg），但需注意避免過載（導致條帶飽和，影響定量）；

抗體與底物選擇：

選擇高親和力一抗（如羅氏 Anti-p53 Antibody，KD=10?12 mol/L，結合能力是普通抗體的 1000 倍），二抗選擇高偶聯效率的產品（如羅氏 HRP-Conjugated 二抗，DOL=2-3）；

使用增強型 ECL 底物（如羅氏 Lumi-Light™ Plus Substrate，發(fā)光強度是普通底物的 5 倍），延長曝光時間（如從 1 分鐘增至 10 分鐘）；

檢測儀器升級：

使用高靈敏度成像儀（如羅氏 ChemiDoc™ MP Imaging System，配備高分辨率 CCD 相機，檢測下限達 0.1 pg），避免使用 X 光片（曝光時間固定，難以捕捉弱信號）。

（二）問題 2：定量結果重復性差（多次實驗的灰度值 CV＞15%）

可能成因

操作不標準化：上樣量不一致（如手動加樣時，每孔體積偏差＞1 μL）、孵育時間 / 溫度波動（如一次 4℃過夜，一次室溫 2 小時）；

試劑批次差異：不同批次的一抗親和力不同（如多克隆抗體制備過程中，批次間特異性差異）、ECL 底物發(fā)光效率波動（如不同批次的底物活性差異）；

儀器未校準：成像儀的灰度值檢測未校準（如每次實驗的曝光參數不同，導致灰度值無法比較）、分析軟件參數設置不一致（如閾值選擇不同）。